La distribuzione dei virus HPV ad alto e basso rischio in Italia

In uno studio recente (1), 3410 donne sono state sottoposte a test HPV e Pap test.

La prevalenza di HPV ad alto rischio osservata in relazione alle lesioni è la seguente:

  • Donne con Pap test normale: 7% mostrano HPV ad alto rischio
  • Donne con ASC-US: 29% mostrano HPV ad alto rischio
  • Donne con L-SIL: 68% mostrano HPV ad alto rischio
  • Donne con ASC-H: 60% mostrano HPV ad alto rischio
  • Donne con H-SIL: 65% mostrano HPV ad alto rischio

La prevalenza di HPV a basso rischio osservata in relazione alle lesioni è la seguente:

  • Donne con Pap test normale: 3,6% mostrano HPV a basso rischio
  • Donne con ASC-US: 14% mostrano HPV a basso rischio
  • Donne con L-SIL: 32% mostrano HPV a basso rischio
  • Donne con ASC-H: 0% mostrano HPV a basso rischio
  • Donne con H-SIL: 12% mostrano HPV a basso rischio
La diagnosi del papilloma virus HPV[/title]

La diagnosi papilloma virus HPV è molecolare, perché il virus non si propaga in coltura.

Il virus è costituito da DNA a doppia elica, con circa 8000 paia di basi nucleotidiche. La struttura è ben nota, e il genoma dell’HPV codifica le seguenti proteine:

  • E1 ed E2 (regolatorie)
  • E6 ed E7 (che determinano la trasformazione tumorale)
  • L1 ed L2 (del rivestimento capsidico)
  • E4 (funzione sconosciuta)
virus_hpv
tratto da Virol J. 2012; 9: 262
 

Gli unici metodi che hanno attualmente l’approvazione dell’agenzia statunitense FDA (Food and Drug Administration) per l’utilizzo nella diagnosi sono:

  • Il test Digene® HPV che usa la tecnologia Hybrid Capture® 2 (hc2)
  • il test Cervista® HPV

Il test Digene® HPV

Consiste nell’amplificazione del segnale non radioattivo basata sulla ibridizzazione del DNA dell’HPV con sonde ad RNA marcate. Questo test identifica 13 tipi virali ad alto rischio (-16,-18,-31,-33,-35,-39,-45,-51,-52,-56,-58,-59 and -68) o 5 tipi virali a basso rischio (-6, -11, -42, -43, and -44) (1).

Questo test distingue tra tipi ad alto e a basso rischio, ma non è adatto a genotipizzare il singolo HPV (cioè non si può sapere se si ha specificamente il tipo HPV 16 o il tipo HPV 18). Questo dato invece è importante da conoscere, perché la possibilità di avere una lesione pre-tumorale da infezione persistente è del 10-15% se il tipo virale è il -16 o il -18, mentre è meno del 3% per tutti gli altri tipi virali combinati (2-4).

Il test Cervista® HPV

Consiste nell’amplificazione del segnale non radioattivo basata sulla ibridizzazione del DNA dell’HPV con sonde ad RNA marcate. Questo test identifica 14 tipi virali (-16,-18,-31,-33,-35,-39,-45,-51,-52,-56,-58,-59,-66 e -68). Questo test appare migliore rispetto al test Digene® HPV nell’identificare le lesioni di alto grado (H-SIL) e presenta un minor tasso di falsi positivi, e una più alta sensibilità e specificità nella genotipizzazione dell’HPV -16 e -18 (5-6).

Micro-array

Questo metodo usa l’amplificazione tramite PCR, e il prodotto dell’amplificazione del DNA in milioni di copie viene ibridizzato su un chip, sul quale uno scanner per il DNA identifica la presenza del virus.

Il vantaggio di questa metodica è che si possono effettuare analisi in parallelo di molti campioni di DNA. Alcuni studi dimostrano che l’analisi microarray accoppiata con la PCR può essere efficacemente applicata per la scoperta e genotipizzazione dell’HPV.

PapilloCheck®

Questo metodo indentifica e genotipizza 24 tipi di HPV in una singola reazione (HPV -6, -11, -16, -18, -31, -33, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -55, -56, -58, -59, -66, -68, -70, -73, -82). Per far questo, utilizza una PCR multiplex, con primers fluorescenti, per amplificare 350 paia di basi del gene E1 dell’HPV, che vengono analizzate con metodica microarray.

I principali vantaggi di questo metodo sono la identificazione di virus HPV ad alto e basso rischio, e la determinazioni di infezioni multiple, e può essere considerato un test di screening affidabile. Tuttavia questo metodo non amplifica il tipi -35 e -53, il costo è relativamente alto, e richiede specifici apparati.

Polymerase chain reaction (PCR)

Questo metodo è altamente sensibile, specifico e largamente utilizzato. Consiste sostanzialmente nell’amplificazione del messaggio genetico del virus in milioni di copie, dopo 30 cicli di amplificazione.

Questo metodo ha il vantaggio di amplificare separatamente diversi tipi virali. Il maggior limite è un certo numero di falsi negativi in caso le copie virali siano troppo basse e di conseguenza può non identificare tutti i tipi virali presenti nel campione analizzato.

PCR-RFLP (restriction-fragment length polymorphism)

Metodo semplice ed efficace, oltre che poco costoso. Consente di distinguere efficacemente tipi ad alto e basso rischio, ed è possibile identificare infezioni singole o multiple.

Real-time PCR

Metodo affidabile, sensibile e specifico. Ha il vantaggio di:

  • determinare la carica virale, cioè il numero di copie presenti nel campione
  • identificare multipli tipi virali
  • si può usare con basse quantità di DNA
  • è riproducibile, rapido e applicabile in clinica

Abbott real-time PR

Determina individualmente il tipo -16 e -18, e insieme in pool 12 genotipi (-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66 and -68)

COBAS® 4800 HPV test

Questo metodo identifica 14 tipi virali, individualmente il tipo -16 e -18, e insieme in pool 12 genotipi (-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66, and -68).

Questo metodo risponde a tutti i criteri delle linee guida internazionali per essere validato per lo screening, ed è affidabile per individuare i tipi ad alto rischio. I risultati si possono ottenere in 4 ore. E’ stato anche validato per il triage delle lesioni ASC-US.

Sequenziamento del genoma dell’HPV

Non validato per uso clinico.

CLART® human papillomavirus 2

E’ un metodo di amplificazione che usa primers biotinilati che copiano un frammento di DNA dentro la regione L1 dell’HPV. Consente di identificare 35 tipi virali (-6, -11, -16, -18, -26, -31, -33, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -56, -58, -59, -61, -62, -66, -68, -70, -71, -72, -73, -81, -82, -83, -84, -85 -89).

INNO-LiPA

E’ un metodo di amplificazione che usa primers biotinilati che copiano un frammento di DNA dentro la regione L1 dell’HPV e dentro il gene HLA-DP1. Consente di identificare 14 tipi virali. Tuttavia non identifica alcuni tipi ad alto rischio (-35, -39, -52, -56 and -66) ed è meno efficace per identificare il -42 ed il -59.

Linear array®

Determina 37 tipi virali che includono 15 ad alto rischio (-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73 -82), 3 a probabile alto rischio (-26, -53 and -66), 10 a basso rischio (-6, -11, -40, -42, -54, -61, -70,-72, -81 -CP6108) e 9 genotipi dal significato incerto (-55, -62, -64, -67, -69, -71, -83, -84 -IS39).

Clinical arrays® HPV

Determina 35 tipi virali che includono 20 ad alto rischio (-16, -18, -26,-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -66, -68, -70, -73, -82, -85), e 15 a basso rischio (-6, -11, -40, -42, -43, -44, -54, -61, -62, -71, -72, -81, -83, -84, -89).

Microplate colorimetric hybridization assay (MCHA)

Identifica 6 tipi virali ad alto rischio (-16, -18, -31, -33, -39, -45).

HPV-mRNA (RNA messaggero)

E6 and E7 sono i principali geni che determinano la trasformazione tumorale mediata dal virus HPV ad alto rischio.
Serve a migliorare la sensibilità e specificità dei test di screening, e a determinare la capacità delle lesioni cervicali di progredire in senso tumorale. I metodi principali per determinare l’RNA messaggero degli oncogeni E6/E7 sono 2:
PreTect® Proofer (5 tipi virali -16, -18, -31,-33, and -45)
APTIMA® HPV Assay (14 tipi virali -16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66, and -68)

Bibliografia

1. Giorgi Rossi P, Chini F, Bisanzi S, Burroni E, Carillo G, Lattanzi A, Angeloni C, Scalisi A, Macis R, Pini MT, Capparucci P, Guasticchi G, Carozzi FM. Distribution of high and low risk HPV types by cytological status: a population based study from Italy.m Prevalence Italian Working Group. HPV.Infect Agent Cancer. 2011 Jan 20;6:2.
2. Hwang SJ, Shroyer KR. Biomarkers of cervical dysplasia and carcinoma. J Oncol. 2012;507286 Epub 2011 Oct 29.
3. Bozzetti M, Nonnenmacher B, Mielzinska II, Villa L, Lorincz A, Breitenbach VV. et al. Comparison between hybrid capture II and polymerase chain reaction results among women at low risk for cervical cancer. Ann Epidemiol. 2000;10:466.
4. Wright TC Jr, Schiffman M. Adding a test for human papillomavirus DNA to cervical-cancer screening. N Engl J Med. 2003;348:489–490. doi: 10.1056/NEJMp020178.
5. Frazer IH, Leggatt GR, Mattarollo SR. Prevention and treatment of papillomavirus-related cancers through immunization. Annu Rev Immunol. 2011;29:111–138. doi: 10.1146/annurev-immunol-031210-101308.
6. Einstein MH, Martens MG, Garcia FA, Ferris DG, Mitchell AL, Day SP. et al. Clinical validation of the Cervista HPV HR and 16/18 genotyping tests for use in women with ASC-US cytology. Gynecol Oncol. 2010;118:116–122.
7. Bartholomew DA, Luff RD, Quigley NB, Curtis M, Olson MC. Analytical performance of Cervista HPV 16/18 genotyping test for cervical cytology samples. J Clin Virol. 2011;51:38–43.